中性纤维素酶一般在26-31℃条件下为适宜，温度低于26℃高于35℃纤维素酶会失去活性。
不一样来源的中性纤维素酶有不同的反应条件。常见的纤维素酶产生菌中，如曲霉、青霉及木霉，产生的酶一般为酸性酶。酶的适宜温度大多在45~65℃中间,适宜pH值大多在4.0~5.5中间。一些嗜碱和耐酸性的细菌,如Bacillus属中的某些种,能够产生在偏碱条件下维持较基酶的纤维素酶。对于深海细菌,王玢等分离出细菌产纤维素酶适宜反映温度为35℃,适宜pH数值6.0,属酸性酶。曾胤新等分离出细菌所产纤维素酶的适宜功效温度皆为35℃。
中性纤维素酶取两支干净试管编号为甲~乙，在两支试管中分别加入等量的含纤维素酶的适宜pH缓冲溶液和适宜的pH缓冲液。然后再各加入相同的滤纸条，在相同的时间内观察滤纸条消失的情况。