1、常用的定量分析方法:标准曲线法、直接定量(外标法和内标法)
2、层析柱主要有:弗罗里硅土柱、氧化铝柱、硅胶柱、活性碳柱、其他填料层析柱子
3、液相色谱的特点是:、高速、高灵敏度、高度自动化
4、气相色谱仪常用的检测器有:火焰离子化检测器(FID)、火焰光度检测器(FPD)
电子捕获检测器(ECD)、氮磷检测器(NPD)、原子发射检测器
5、检测器的评价指标:噪声、漂移、灵敏度、线性范围与动态范围
6、气相色谱柱有:填充柱、毛细管柱(开管型和填充型)
层析填料的用途
用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等,或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体,也可使用其他物质。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析(column chromatogra-phy),在玻璃板上涂上一层薄而均的物质作为固定相的称为薄层层析(thin-layer chromatography),后者可与用滤纸作为固定相的纸上层析进行同样的分析,即在固定相的一端,点上微量试料,在密闭容器中,使移动相(液体)从此端渗入,移动接近另一端。通过这种展开操作,各成分呈斑点状移动到各自的位置上,再根据Rf值的测定进行鉴定。当斑点不易为肉眼观察时,可利用适当的显色剂,或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。也可采用在种移动相展开后再用另一移动相进行展开(这时的展开方向应与原方向垂直),使各成分分离完全的双向层析(two-dimensional chromatography)。
选择层析方法
用分离范围宽广的凝胶过滤介质如Superose, Sephacryl HR依据分子量将样品分成不同组份
用含专一配体或的亲和层析介质结合目标蛋白,一步即可得到高纯度样品;亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质
体积大的样品,往往使用离子交换层析来浓缩和粗纯化;高盐洗脱的样品再用疏水层析纯化
疏水层析用高盐吸附,低盐洗脱的原理,洗脱的样品又可直接上离子交换介质;两种方法常被交替使用
疏水层析
生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域,在不同环境下,与各种疏水介质产生不同强弱的结合
高离子强度可加强疏水性
跟离子交换相反,高盐吸附,低盐洗脱;洗脱样品又可直接或稍加稀释后加上其他层析柱,作为连接层析步骤的桥梁,取代盐析沉淀技术
比反相层析的配体密度低很多,无须洗脱,保存生物活性
配体种类繁多,很难预测哪一种、哪一个条件适合,可用疏水层析试盒选择介质
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