恒温扩增试剂盒

本试剂盒可以用于RT-LAMP等温扩增,RT-LAMP即逆转录和Loop-Mediated Isothermal Amplification(环介导等温扩增)的结合,专门用于快速扩增RNA。LAMP是2000年才出现的一种新颖的等温核酸扩增方法。它利用4或6条模板专一的特异引物和具有链置换能力的DNA聚合酶,在等温条件下(63℃左右)30-60分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于RT-PCR技术,同时还不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程,不依赖任何专门的仪器设备。目前已成功应用于人类及动植物、细菌、真菌等病原体的快速检测。

恒温快速扩增试剂盒常用酶原料有哪些？

逆转录酶逆转录酶又称反转录酶，是一种RNA介导的DNA聚合酶，其反应过程中体现出三种功能为：以RNA作为模板合成互补DNA链 (complementary DNA, cDNA)，形成RNA:cDNA杂交链；发挥RNase H活性，降解RNA:DNA杂交链中的RNA模板；以cDNA作为模板合成第二链DNA，形成双链DNA（如下图）。其中，RNaseH活性是逆转录酶的一个内在特性，可在合成过程中同时切割RNA:cDNA杂合链中的RNA模板，该特性可能降低逆转录效率，因此在实际应用中，常采用人工改造后的低或无RNase H活性的逆转录酶。常用的逆转录酶有AMV和M-MLV，AMV分离自禽类成髓细胞瘤病毒(Avian Myeloblastosis Virus, AMV)，M-MLV逆转录酶分离自莫洛尼氏鼠病毒(Moloney Murine Leukemia Virus, MMLV)，前者热稳定性优于后者，但AMV逆转录酶的RNaseH活性也更强，不利于长片段cDNA合成。市面上多使用经基因工程改造过的M-MLV逆转录酶，其热稳定性改进，可在50℃左右工作，同时RNase H活性进一步减弱，提高了其逆转录效率。

恒温扩增常用酶

恒温扩增的方法多种多样，其对应的酶体系也各有差别，且一般为多酶体系，在酶原料选择上相比PCR复杂，下面只列举一些主要的恒温扩增方法相关酶。

LAMP相关酶环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)所用酶主要为具有链置换功能的DNA聚合酶，详细原理可参考聊聊恒温扩增技术。常用酶为Bst DNA聚合酶，用于DNA链合成，同时具有链置换功能；若检测模板为RNA，则可加入逆转录酶配制成RT-LAMP反应体系。

恒温扩增试剂盒操作步骤

提前30分钟将试剂盒所需组分取出,室温融化。鹿荡混匀。

1).每个干粉反应管加入29.4 uL Abuffer (注意: Abuffer需完全融化混匀,否则会对实验效果产“生影响) ; 1.每个干粉反应管加入29.4 uLAbuffer (注意: Abuffer需完全融化混匀,否则会对实验效果产生影响) ;

2.每个反应管分别加入2 uL上游引物、2 uL下游引物和0.6 μ探针(引物和探针浓度为10 μM ,对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中)