恒温快速扩增试剂盒出现假阳性的结果，可能的原因有哪些？

如果在无模板对照中观察到假阳性结果，则通常是由污染引起的。我们建议区分试剂配制区和扩增分析区。在使用任何扩增后打开反应管的终点检测方法时，必须采用严格的污染控制措施。要排除或清除污染，我们建议用消毒液或 75%的酒精对工作区域进行消毒，并使用新的扩增试剂（溶解剂等）。可能需要重复几次清洁，才能完全清除污染。

恒温快速扩增试剂盒常用酶原料

尿DNA糖基化酶尿DNA糖基化酶(UDG酶)又称尿-N-糖基化酶(UNG酶)，可水解含尿的单链和双链DNA释放出游离尿，而对RNA无活性，与dUTP搭配使用，可建立成PCR防污染体系。其原理如下：在PCR体系中将dTTP部分或全部替换为dUTP后，使得反应生成含有dU碱基的扩增产物，这些扩增产物不同于天然模板，在进入含有UDG酶的反应体系时，可被UDG酶识别并切割尿碱基与糖磷酸骨架间的N-糖基键，而经切割后的DNA链在碱性或高温条件下易于断裂降解，从而失去被当作模板再扩增的能力，因此可防止扩增子污染（如下图）。市面上的UDG酶主要有普通型和热敏型，其中热敏型UDG酶在室温条件下即可催化反应，50℃以上加热可使其灭活，防止其降解后续PCR形成的含dU扩增产物。虽然UDG/dUTP体系具有防污染功能，但在实际测试中还得兼顾PCR的效率和灵敏度。一方面需确保PCR扩增产物掺入足够量的尿碱基，从而可被UDG有效切割；另一方面也需要保证反应体系添加的dUTP不会明显影响PCR效率，因此dTTP和dUTP的佳比例需通过优化确定。

科普｜恒温扩增试剂盒常用酶原料

NEAR相关酶

切口酶扩增反应(Nicking Enzyme Amplification Reaction, NEAR)是一种基于切刻内切酶切割特性的恒温扩增方法，详细原理可参考啥黑科技可10分钟完成核酸分子检测？。其使用的酶有两种：切刻内切酶：如Nt.BstNBI切刻内切酶，该类酶不同于常规限制性内切酶，其识别特定序列后仅在DNA其中一条链上切割形成缺口，并暴露出游离的3’端；DNA聚合酶：如Vent (exo-) DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶，用于DNA链合成，同时具有链置换功能。

恒温扩增试剂盒设计及储存

荧光探针设计:

在上下游引物中间,设计- -段长度为46-52nt与目的片段互补的序列作为荧光探针;

探针序列不与特异性引物识别位点重叠,长度为46-52 nt ,序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。

试剂盒储存:

运输条件:低温运输;

储存条件:储存温度≤-20°C ,避光保存,避免重压、反复冻融:

产品有效期: 12个月。