核酸电泳
影响核酸电泳分辨率的重要因素
研究结果表明:在低浓度、低电压下,分离效果较好。在低电压条件下,线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是,在电场强度增加时,较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的上升,电泳分辨率反而下降,为了获得电泳分离DNA片段的所需分辨率,电场强度不宜大于15V/cm。一般在5-10v之间。 电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳,只有当凝胶浓度低于0.5%时,为增加凝胶硬度,可在4℃,进行电泳。
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蛋白凝胶电泳的分类
蛋白凝胶电泳分为非变性凝胶和变性凝胶
所谓非变性凝胶,即在凝胶中不加SDS和尿素等变性剂,这种凝胶中,蛋白质仍保持活性,其迁移率受它的静电荷与分子大小两个因素的影响。因此在非变性凝胶中进行电泳是不能测得分子量的,常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。
所谓变性凝胶,即在凝胶中加入变性剂,如尿素、SDS(十二烷基磺酸钠)、DTT等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构,把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。蛋白质在这种变性凝胶中的迁移率与它们分子量的对数成直线关系。因此利用变性凝胶进行电泳可以测得蛋白质的分子量。目前应用较多的变性剂为SDS。
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转印电泳(湿转)实验的操作
转印电泳湿转方式的操作介绍
湿转(一般是恒压转印,100V,时间2h左右):转印缓冲液,三明治结构 ,底层海绵,往上依次是3-4层滤纸,凝胶,膜,3-4层滤纸,海绵
海绵和滤纸在使用前要用转移液浸泡,在制作三明治结构时一定要避免凝胶干燥,滤纸内的气泡要用玻璃棒赶走
膜在用之前都要活化,PVDF膜要先浸泡5S-30s,然后在转移缓冲液中平衡,目的是活化膜上的正电基团,NC膜直接在转移液中平衡即可
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