干细bao培养诱导分化

     干细bao是一类具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞，理论上具有分裂能力，在特定条件下，可分化成特定组织。常用的解链方法为盐酸加热、蛋白酶处理等，使DNA双链部分单链化，抗Brdu小鼠单与增殖细胞核内的Brdu结合，再经酶标抗小鼠IgG孵育、呈色，显示进入S期细胞的情况。通常改变抑制 ES 细胞不分化状态的培养条件, ES 细胞就可以分化成多种细胞类型。ES 细胞具有的这种能力在体外增殖并保持未分化状态及其多向分化潜能的生物学特性,使其广泛应用于生物学研究的各个领域, 它的潜在医学应用价值已成为世界范围内研究的热点。目前，已报道的自ES细胞诱导分化的细胞主要包括胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、成骨细胞、软gu细胞和黑素细胞等。

细胞分化

细胞分化是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。3D细胞培养3D多细胞肿liu球是在体外应用组织培养方法使肿liu细胞以多细胞集聚体的形式生长成为具有三维结构的球体。细胞分化的本质是基因组在时间和空间上的选择性表达，通过不同基因表达的开启或关闭，终产生标志性蛋白质。细胞诱导是指将一群不同类型或者形态结构、功能特征存在差异的细胞通过生物学、物理学等手段，将之转变为具有相似/相同形态结构、功能特征的细胞群体的过程。

软琼脂培养克l隆形成试验基本步骤:

(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活l细胞计数，用含20%胎牛血l清的DMEM培养液调整细胞密度至1x106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。

(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40日中不会凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2xDMEM培养基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2xDMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37回5%CO2温箱中培养10~14天。

(5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞数。计算形成率。软琼脂培养法常用检测肿l瘤细胞和转化细胞系。虽然3D多细胞肿liu球模型具有更显著的实体肿liu生理相关性，但是与2D贴壁细胞培养模型相比，获得大量相对统一的3D多细胞肿liu球模型需要-系列的培养过程和表征手段。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40日。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克l隆形成试验。

软琼脂集落形成率实验(软琼脂克l隆)

将1.2%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.6%的底层琼脂，6孔板中每个孔1.4ml温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个/ml，将0.6%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.3%的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul单细胞悬液(约1000ell/wel)， 混匀，室温凝固。细胞生物学服务南京英瀚斯生物科技公司自建有标准的细胞培养房，配备有生物安全柜、超净工作台、细胞三气培养箱、二氧化碳细胞培养箱、荧光倒置显微镜、体视镜、、流式细胞仪等设备。置于37目，5%CO2的细胞培养箱中培养2-3周，计数含50个细胞以上得克l隆，计算细胞集落形成率，Spotll 采集图像。

Q:中的沉淀物对细胞培养有什么影响？

A:（1）细胞生长，我们的试验以及经验表明沉淀物不会影响细胞培养，我们的客户以及其它生产商也证明了这一点。

（2）过滤，如果中出现大量的沉淀物，将很难过滤。一般说来，因为在生产工序中已经过 100nm 或者 40nm 的过滤处理，并且经过了严格的无菌检测，因此不推荐再过滤用于细胞培养 的。平板克l隆形成实验基本步骤::1、取对数生长期的各组细胞，分别用0。在实验室中没有必要再过滤处理，在大规模的细胞培养中往往将直接加到培养基中一起 过滤。

（3）污染，磷酸钙往往被误认为微生物污染而引起。研究者可能会在中观察到一些絮状的 沉淀，因此就会比较警觉的去做无菌试验，将放在培养箱中培养几天，结果可能会观察到更多的絮状 沉淀，因此就断定被污染了。并且当研究者将样品放在倒置显微镜下观察时往往可以看到一些可 以运动的小黑点，因此就更加确认是被污染了。干细bao培养诱导分化干细bao是一类具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞，理论上具有***分裂能力，在特定条件下，可分化成特定组织。于是，研究者就会花费更多的时间和精力来和生产商 确认，但终确定没有被污染而只是沉淀。为了避免这些问题的发生，我们建议不要直接将放在 培养箱中培养观察是否有菌，而是将加到琼脂板上进行培养以观察是否有细菌生长。另外，也可以进 行革兰氏染色，在油镜下观察，以确认是否有污染。