二、使用说明

1、装载探针

对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的刺激细胞。对于细胞刺激

时间较长（通常为6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的刺激细胞，后装载探针。

原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1：1000用无培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA的体积为1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。免yi共沉淀（Co-IP检测）是以抗ti和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的方法。用无细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

2.引物纯化方式有哪些，如何选择？

◆　脱盐

寡核苷酸合成后，为了纯化寡核苷酸成为天然的DNA结构，首先必须去除保护基团。通过浓氨水处理，合成的寡核苷酸从固相载体上分离，2-乙氧基--磷酸二脂键的保护基团，以及碱基的保护基团基（苯甲酰基和异丁基）被去除，从而形成了天然的DNA结构。然而，必要的去保护步骤完成后，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质，但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。然而，脱盐的寡核苷酸还是能够满足ＰＣＲ检测等基础生物研究。

◆　BioRP / OPC纯化

如果寡核苷酸以“三苯”的形式合成，则N-寡核苷酸包含5’-DMT基团，提前终止的寡核苷酸不包含该基团。因为DMT基有强的亲脂的特性，有5’-DMT基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性，因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5’－DMT寡核苷酸存在强亲和力，但是提前终止的寡核苷酸不包含DMT基团，所以，我们能够成功的把想要的N-寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。microRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达（新发现miRNA也能在转录水平调控基因表达）。

9.如何计算引物的Tm值？

答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：

Tm =            4℃   (G + C)+ 2℃   (A + T)

对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size

公式中，Size = 引物长度。

Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrati favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cati stabilize the DNA duplexes.