分析试剂盒配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 温育：操作同3。 洗涤：操作同5。 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

3~5分子的生物素与1分子的蛋白结合实验实验步骤：

1. 溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。

2. 在打开之前，平衡生物素至室温。加2 mg Sulfo-NHS-Biotin于100 ul 超纯水中，加入足够量浓度的生物素，一般对于10 mg/ml 蛋白来说超过12倍分子数，对于2 mg/ml 蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中

3. 室温30分钟，或冰上放置2小时。

4. 用30 ml PBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5 ml 或1 ml 于单独的管中。

化学试剂的有效性是影响实验结果准确性的重要因素

试剂的有效性是影响实验结果准确性的重要因素，我们总是习惯于用生产日期来判断化学试剂的有效期，但其实这是不准确的。化学试剂不像食品和药品有严格的保质期，它的有效期受多方面因素影响。

化学试剂一般没有注明保质期，一般情况下，化学性质越稳定，保质期就越长，根据化学试剂的理化性质与实际经验，一般遵循以下几个原则（一般原则，不是原则）：只要妥善保管，包装完好无损,理论上可以长期使用。但是容易氧化(如亚硫酸盐、、亚铁盐、碘化物、硫化物等) ，容易潮解的物质,在避光、阴凉、干燥的条件下，只能短时间(1～5 年)内保存，具体要看包装和储存条件是否符合规定。

试剂稳定性试验来确定开封后的有效期

那这样就没办法确实有效期了吗？我们一般规定化学试剂开封后的有效期，因为按生产日期规定有效期是不合适的，有很多试剂可能买进来时就快过期了。有效期可以按稳定的和不稳定的来区分，对于稳定的，是指那些不易被氧化、降解、吸湿、脱水的试剂，这类试剂可以规定得有效期时间长一些，当然这也可以结合使用频率和使用量的情况；对于不稳定性的试剂，则要根据检验需求来确定合适的有效期，而这些可能往往来源于检验偏差和OOS。因为在成本允许的情况，大家都不想去做试剂稳定性试验来确定开封后的有效期。