随后基于这些结果,研究了TK反应的可逆性(模拟逆偶环缩合),用于用适当的 TKgst 变体裂解脂肪族 α-羟基酮(方案 B)。构建TKgst突变体库在戊糖磷酸途径中,磷酸化醛糖 (C-C)和酮糖 (C-C) 分别是TK的受体和供体底物。为了提高TKgst对非磷酸化α-羟基酮- 的活性(表),根据通过位点饱和诱变 (SSM) 进行的半合理诱变在目标位置修改了TKgst活性位点。TKsce、TKec和来自的TK (TKban) 等微生物TK的D结构具有很强的蛋白质序列同源性。稳定TK 底物的关键残基是相同的,并且与ThDP具有相似的方向。
单个TKgst突变体DI、LF、FI和LI 在大肠 BL菌株中表达并进行纯化。将TKgst突变体与型TKgst对(S)-羟基酮-的活性进行了比较(Chart )。(S)-,,-trihydroxybutan--one (l-erythrulose,) 是型TK的非磷酸化底物之一,被选为对照。型和突变体对表现出的活性,除了DI,它是被脂肪链取代的极性残基。非极性残基Ile代替Asp显着降低酶的活性,可能是由于缺乏与的C的羟基的相互作用。脂肪链对其他非极性残基的突变对活性没有影响。
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