pcr扩增的原理

实验方法原理

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留copy原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复1制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复1制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

典型的PCR包括高温变性、低温退火、中温延伸三个步骤，通过将这一套过程不断循环，使DNA得以成百万倍的扩增。

反向PCR( Inverse PCR, IPCR术

原理:反向PCR是克1隆已知序列旁侧序列的一种方法，主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA.后酶切片段自身环化.以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA的部分片段，大小取决于.上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。

该方法的不足是:①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA部分片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

不对称PCR(asymmetric PCR）枝术

两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR.在扩增循环中引入不同的引物浓度.常用50~ 100+1比例。在起初的10~ 15个循环中主要产物还是双链DNA.但当低浓度引物被消耗尽后。高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA.

应用:可制备单链DNA部分片段用于序列分析或核酸杂交的探针。

反转录PCR(reverse transcription, RT- PCR技术

当扩增模板为RNA时。需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT - PCR应用非常广泛。无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。

修饰引物PCR技术

为达到某些特殊应用目的.如定向克1隆、定1点突变、体外转录及序列分析等。可在引物的5*-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等。