典型的腺病毒载体系统如:穿梭质粒pCA13/腺病毒基因组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。pCA13/的HCMV IE启动子-多克1隆位点-SV40 AN(poly A)构成外源基因的表达盒,该表达盒的插入使腺病毒E1基因缺失,但是保留其两端侧翼序列(左侧的1~3bp的ITR,右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力必须的蛋白IX的基因),也保留了腺病毒的包装信号
φ(194~358bp);pBHG11则保留了腺病毒基因组的绝大部分,但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距(mu)部分的E1区、77.5~86.2mu的E3区,293细胞是整合有Ad5 E1基因的人胚shen细胞系。pBHG11因为缺失包装信号及E1区而不能copy,pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列,但是缺失E1区及腺病毒绝大部分基因组,同样不能copy。外源目的基因插入pCA13后,与pBHG11共转染,进入293细胞。pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组,同时,293细胞提供E1蛋白,从而包装产生腺病毒颗粒。该病毒的蛋白质外壳同野1生型腺病毒相似,具有同样的感1染力进入靶1细胞的能力,但是基因组DNA的E1区被外源目的基因取代,即进入靶1细胞后病毒不能copy,但可以表达目的蛋白。
第yi代腺病毒载体:一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体称为第yi代腺病毒载体,此类型载体在未经过纯化时可引发机体产生较强的炎1症反应和免1疫反应,纯化后可以安全使用,体内表达周期可达4周。
第二代腺病毒载体:E2A或E4基因缺失的腺病毒载体被称为第二代腺病毒载体,产生的免1疫反应较弱其载体容量和安全性方面有所改进,但病毒包装难度和出毒和病毒滴度下降厉害,应用相当局限。
第三代腺病毒载体:第三代载体缺失了全部的(无病毒载体,gutless vector)或大部分腺病毒基因(微型腺病毒载体,mini Ad),仅可保留ITR和包装信号序列。第三代腺病毒载体zui大可插入35kb的基因,病毒蛋白表达引起的细胞免1疫反应进一步减少,载体中引入核基质附着区基因可使得外源基因保持长期表达,并增加了载体的稳定性。这一载体系统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
腺病毒载体应用优势
腺病毒载体转0基因效率较高,体外实验通常接近100%的转导效率;可转导不同类型的人组织细胞,不受靶1细胞是否为分裂细胞所限;容易制得高滴度病毒载体,在细胞培养物中重组病毒滴度可达(10E+11)/ml;进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组,仅瞬间表达,安全性高。因而,腺病毒载体在基因治1疗临床试验方面有了越来越多的应用,成为继逆转录病毒载体之后广泛应用且非常具前景的病毒载体。
基因有两个特点:一是能忠实地自己,以保持生物的基本特征;二是在繁衍后代上,基因能够“突变”和变异,当受精卵或母体受到环境或遗传的影响,后代的基因组会发生有害缺陷或突变。绝大多数产生疾病,在特定的环境下有的会发生遗传。也称遗传病。在正常的条件下,生命会在遗传的基础上发生变异,这些变异是正常的变异。基因的与表达含特定遗传信息的核苷酸序列,是遗传物质的小功能单位。除某些病毒的基因由核糖核酸(RNA)构成以外,多数生物的基因由脱氧核糖核酸(DNA)构成,并在染色体上作线状排列。基因一词通常指染色体基因。在真核生物中,由于染色体在细胞核内,所以又称为核基因。位于线粒体和叶绿体等细胞器中的基因则称为染色体外基因、核外基因或细胞质基因,也可以分别称为线粒体基因、质粒和叶绿体基因
版权所有©2024 天助网