核糖核酸(缩写为RNA,即Ribonucleic Acid),存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸,核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种,即A(腺piao呤)、G(鸟piao呤)、C(胞C4H4N2)、U(尿C4H4N2),其中,U(尿C4H4N2)取代了DNA中的T。核糖核酸在体内的作用主要是引导蛋白质的合成。
人体一个细胞含RNA约10pg(含DNA约7pg)。与DNA相比,RNA种类繁多,分子量较小,含量变化大。RNA可根据结构和功能的不同分为信使RNA和非编码RNA。非编码RNA分为非编码大RNA和非编码小RNA。非编码大RNA包括核糖体RNA、长链非编码RNA。非编码小RNA包括转移RNA、核酶、小分子RNA等。小分子RNA(20~300nt)包括 miRNA、 SiRNA、 piRNA、scRNA、 snRNA、 snoRNA等,细菌也有小分子RNA(50~500nt)。
回收产物的检测
1.紫外分光光度计法检测DNA在OD260处有明显吸收峰,当OD260=1时,相当于大约50 ng/μL双链DNA、40 ng/μL单链DNA。OD260/OD280≈1.6~1.9时,说明DNA纯度较高。若洗脱时不用洗脱缓冲液,而是用去离子水,会使比值偏低,因为离子的存在会影响吸光度。但不表示纯度低。
2.SYBR法检测取回收产物1 μL,与1 μL SYBR染料混匀,于荧光透1视仪下观察是否有黄绿色荧光。
3.琼脂糖凝胶电泳法检测取回收产物5 μL,与10×Loading Buffer混匀,DNA Marker加5 μL,电泳后凝胶成像观察。5 μL DNA Marker相当于每个条带50 ng DNA,观察目的条带亮度大致为Marker的两倍,则大致估算其浓度约为20 ng/μL。
植物DNA的SDS提取法:1 取2-3g新鲜叶片,在液氮中研磨成粉状(防止溶化)后转入15ml离心管中。2 加入5ml于65℃预热的提取缓冲液,65℃水浴保温30min(摇动数次),使提取液与样品充分混合。3 加入2ml5mol/LKAc,剧烈振荡,冰浴保温20min以上。4 2700×g离心20min,将上清液倒入新的15ml离心管中,(若提取DNA用于Southern等实验,一般在转移上清时加滤膜,防止样品残渣混入,可保证DNA纯度)。5 加入4ml氯1仿/异戊1醇(24∶1),摇匀,平衡,2700×g离心15min。6 在另一新的15ml离心管中加入5ml预冷的异丙1醇,将上清液用移液***转入此管,在-20℃冷却30min以上。7 2700×g离心10min,弃去上清液,用4ml70%乙醇洗涤,室温保持10min。2700×g离心3min,倒去上清液。8 重复步骤7,用4ml70%乙醇洗涤,室温保持10min。2700×g离心3min,倒去上清液。超净工作台内吹干(3h左右)。9 加1mlTE缓冲液中溶解,加10μlRNase(10mg/ml),在37℃恒温箱中温育20min。10 再加100μl3mol/LNaAc和2ml无水乙醇,2700×g离心3min,倒去上清液。超净工作台内吹干(3h左右)。11 将DNA沉淀溶于150μlTE中,置于超净工作台内(3h左右)。将TE溶液转入已灭菌的1 5mleppendorf管中,-20℃保存备用。
在整个核酸检测的过程中,zui大的挑战是什么?
不是实验室的负压状态,也不是全副武1装的超负荷工作,访问中工作人员不约而同地提到了一个词:准确。新型冠状病毒检测受到患者病程发展以及样本采集等诸多因素的影响,每一个样本都是一道待解的难题,需要排除各种干扰,才能找到准确结果。为了确保检测结果的准确性,只要检测结果存疑,就必须再次复核,还可能要重新检测。
医学实验室主要检测的是血液样本。医学实验室收到口岸送样后,登记、编号、录入信息,血常规检测为自动化操作,每个样本检测时间为1分钟,可实时获得口岸现场被采样入境人员的白细胞和淋巴细胞计数,作为新冠肺1炎的临床表现判断依据之一。卫生检疫综合实验室和医学实验室多种检测方法同时检测,综合判断,确保结果准确性。
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