在选用支原体PCR法检测来替代药典方法时,需要考虑如下两个方面:
首先一步是要使用符合欧洲药典要求,经过全方面验证的支原体检测试剂盒,第二部是自我验证,即确认所用的样本基质对于该试剂盒方法是合适的,并且操作过程是正确的。小规模的室内验证通常需要采用三个不同批次的试剂盒,然后加入10CFU的标准品,做复孔(通常是8个复孔),并且至少选择3个支原体物种进行验证。
有的支原体标准品厂家会提供CFU与基因拷贝数的比值,以方便二者的换算。因为10CFU只能确定PCR能够达到的检测限在10CFU以下,但无法具体确定灵敏度的数值。带DNA拷贝数标定的基因组DNA标准品则可进一步确定检测限的数值。
总之,PCR方法很有用,但需要避免假阴性,验证时应使用阳性对照、阴性对照、无模板对照和内控对照,以保证PCR反应正常,以及支原体少量存在时确实能检出来,支原体不存在时也确保是结果阴性,从而使得PCR方法在工业应用时能确保zui终结果的可靠。
棉花等酚类、多糖类物质较多的植物DNA提取法:
1 取2g新鲜幼嫩的叶片放入研钵中,加入液氮后快速、充分研磨,待成极细的粉末状时迅速转入到50ml离心管中。
2 在50ml离心管中加入10ml冰预冷的提取缓冲液,在涡悬振荡器上充分混匀。
3 于4℃,2700×g离心20分钟,倒去上清液。
4 在沉淀中加入5ml裂解缓冲液,在涡旋振荡器上充分混匀。
5 于65℃水浴锅中温育30min。
6 加入5ml氯1仿/异戊1醇(24/1),并上下翻转以充分混合。
7 于4℃,2700×g离心5分钟。
8 转移上层水相至一新的50ml离心管中。
9 重复步骤7-9一次。
10 加入2/3体积的冰预冷的异丙1醇,并上下翻转以充分混合,至-20℃2h。
11 于4℃,1200×g离心10min。
12 在一新管中加入20ml含80%乙醇15mmol/LNaAc溶液,用玻棒将DNA转入该管(如不能直接用玻棒缠出,可离心后倒出上清,再在其中加入20ml含80%乙醇15mmol/LNaAc溶液),放置20min后稍许离心,移走上清并吸出残存乙醇,室温干燥。
13 加入1 0mlTE(10mmol/LTris-HClPH=8 0,1mmol/LEDTA)并加入终浓度为20(g/L的RNaseA,过夜。
14 风干,用50μlTE缓冲液溶解,存于-20℃备用。
用乙醇沉淀DNA时为什么一定要加NaAc或NaCl
在pH为8左右的溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷, 减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时, 只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时, 其效果也不好。在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀。
加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与KAc来处理?
加进去的RNase本身是一种蛋白质,为了纯化DNA,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加完全。也可用饱和酚、*抽提再沉淀,去除RNase。在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到较好效果。
在基因操作实验中,磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH),可作DNA的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀,在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCl系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定。
新冠核酸检测是对病例确诊的标准之一,是病例早发现、早诊断、早隔离、早cure的关键,也是对传1染源隔离cure和密切接触者医学观察的基础。
新冠感1染人体后,首先会在呼吸道系统中进行繁殖, 因此可以通过检测痰液、鼻咽拭子中的病毒核酸判断人体是否感1染病毒。在感1染一段时间以后(一般是7-10天),人体会产生针对病毒的特异性抗1体,所以用免1疫学检测方法能够检测这些特异性抗1体,判断人体是否感1染过病毒。这就是病毒的核酸检测与抗1体检测。与抗1体检测相比,核酸检测更加灵敏,也是实验室检测的“金标准”。
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