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英文全称是 :in situ hybridization。原位杂交。指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交,从而对特定核酸顺序进行定量定位的过程。
①细胞特异性mRNA转录的定位,可用于基因图谱,基因表达和基因组进化的研究;②组织中病毒DNA/RNA的检测和定位,如EB病毒mRNA、人类状瘤病毒和巨细胞病毒DNA的检测;③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测;所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被。④基因在染色体上的定位;⑤检测染色体的变化,如染色体数量异常和染色体易位等;⑥分裂间期细胞遗传学的研究,如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定,某些的诊断和生物学剂量测定等。
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内源性酶灭活:如果探针的检测是通过酶促法进行的,则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1% H2O2的甲醛溶液处理30min。
石蜡切片的FISH要点
(1)组织固定,采用PH7.2的10%甲醛固定24h是比较适合的,PH很重要。较厚的组织块建议切开后再固定。这一点小编已经反复提过很多次了。良好的固定是所有病理实验的前提。
(2)对于石蜡切片来说,采用蛋白酶K作为消化液是更优的选择。消化条件20g/L蛋白酶K在50℃下消化20min。胃蛋白酶是极易失活的,失活了就没法充分消化,消化过度又会使细胞核变模糊。综合来看,小编更推荐蛋白酶K。
(3)石蜡切片的杂交温度一般都是37摄氏度。而杂交时间则需要摸索才能得到更佳时间。不过,一般的过夜孵育基本可以达到目的。
(4)FISH实验中非特异性着色是个难以避免的问题,我们能做的就是尽量减少背景。具体可作为的地方:充分严格漂洗、全程避免干片、探针浓度不宜太高、杂交温度要控制在37℃。