细胞冻存袋操作需要注意？

1.细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

2.复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

3.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响 细胞生长，CS50冻存袋代理，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，冻存袋代理，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

冻存袋实验前的准备

生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、等速降温机

冷冻方法理论准备:

(1)传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-8O℃16~18小时(或隔夜)--->液氮槽长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量消失，亦可跳过此步骤直接放入-8O℃冰箱中。

(2）程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至（-8o℃以下) -120℃，再放在液氮槽长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

细胞冻存步骤

（1）将标本编号，并用Marker笔仔细标注于冻存管管盖及管壁上，同时将每管编号、内容物、取材日期记录于登记本上。

（2）将冻存管装入冻存袋，戴上棉线手套和防护面罩，迅速放入液氮罐中30～60秒速冻，至冻存组织完全冻住，取出待液氮完全挥发（注意动作轻柔，避免液氮溅洒）。

（3）将经液氮速冻后的组织放入-80℃冰箱相应编号盒中，长期保存。

（4）取材完毕后，200-074-401冻存袋代理，将剩余新鲜标本浸泡于10%中尔马林液中固定（切记不要拿错病理号），做好和当日冰冻值班医生的交接，200-074-400冻存袋代理，避免遗漏。

（5）清洗取材台及取材器具，器具需用消毒液完全浸泡10～15min，清水冲洗后擦干置于干燥处保存备用，取材器具应定期高温消毒。

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