非特异性内切酶鉴定

　　为鉴定非特异性内切酶污染，限制性内切酶与缺少该酶识别序列的超螺旋DNA底物温育。对于RF I型DNA(超螺旋形式)，一个单一的非特异性缺口就会将它转变成RF II型DNA(带缺口环状)。小份的限制性内切酶与1μgDNA在50μl反应体系中，内切酶，采用推荐的NEBuffer，在推荐的温度下温育4小时。两种形式的DNA在琼脂糖凝胶上很容易区分，可以计算出从RF I 到 RF II的转化率。

限制酶的特点

限制酶是识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。

根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子，限制性内切酶可分为两大类，即I类酶和Ⅱ酶。早先从大肠杆1菌中发现的EcoK、EcoB就属于I类酶。

其分子量较大；反应过程中除需Mg2+外，还需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP；在DNA分子上没有特异性的酶解片断，这是I、Ⅱ类酶之间zui明显的差异。

Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。其分子量小于105道尔顿；反应只需Mg2+；重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。

限制酶分布区域

限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶，多者在一属中就有几十种，例如在嗜血杆1菌属中（Haemophilus）现已发现的就有22种。有的菌株含酶量极低，很难分离定性；然而在有的菌株中，酶含量极高．如E. coli的pMB4(EcoRI酶）和H. aegyptius(Hal Ⅲ酶）就是高产酶菌株。据报道从10g的H. aegyptius的细胞中，能分离提纯出可消化l0gλ噬菌体DNA的酶量。细菌是限制性内切酶，尤其是特异性非常强的I类限制性内切酶的主要来源。

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