在酵母双杂交系统中，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，AD与BD会在空间上充分接近，重新构成结构域，启动报告基因的转录。拥有BD质粒的酵母可以在某一缺陷培养基上生长，拥有AD质粒的酵母菌可以在另一种缺陷培养基上生长，通过接合（mating）或共转化使酵母同时拥有AD与BD质粒。如果BD上的目的蛋白与AD上的诱饵蛋白存在相互作用，这样的酵母可以在三缺及四缺的培养基上生长，并启动β-半乳糖苷酶基因的转录。

阻断内源性过氧化物酶：滴加3%1甲1醇-H2O2，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

预杂交：滴加预杂交液，37°C孵育1h。

杂交：倾去预杂交液，滴加含探针has-circ-ST6GALNAC6 probe 杂交液，浓度6ng/ul，恒温箱37度杂交过夜。

杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。

滴加封闭液：滴加封闭血1清（正常兔血1清），室温30min。

滴加鼠抗地1高辛标记过氧化物酶（anti-DIG-HRP）：倾去封闭液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育50min，后PBS洗3次×5min。

        

FISH是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质标记（间接或直接）而得名，植物原位杂交服务公司，该方法在80年代末 被发明，现已从实验室逐步进入临床诊断领域。基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火 温度下复性；通过荧光显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位）的前提下对靶核酸进行分析。DNA荧光标记探针是其中常用的一类核酸探针。利用此探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平 的分析。荧光标记探针不对环境构成污染，灵敏度能得到保障，可进行多色观察分析，因而可同时使用多个探针，缩 短因单个探针分开使用导致的周期过程和技术障碍。



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