蛋白质亚细胞定位的研究方法
1、融合报告基因定位法
将绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生蛋白、β-葡萄糖苷酸酶(GUS)等报告基因,与目标蛋白基因融合在一起,由目标蛋白的引导信号进行亚细胞定位,对报告蛋白的光信号进行跟踪和观察,从而确定目标蛋白的定位。该方法是目前使用广泛的蛋白质亚细胞定位研究方法。
2、荧光标记定位法
将反应与化学光学信号相结合,通过特异性的荧光标记与目标蛋白(抗原)结合,通过荧光信号检测,确定目标蛋白的亚细胞位置。目前标记信号不局限于荧光素,还有同位素、酶、胶体金颗粒、纳米金属颗粒等。
为什么不先对一个基因做预测,在预测的结果上直接做共定位?
不同的预测网站有不同的计算方法,GISH,同一个基因在不同的预测网站也可能得出不同的定位结果。另外所有的结果都应是基于实验得到的,对于不清楚可能定位在哪里的基因,一般推荐先做普通定位,根据普通定位的结果再决定做哪种细胞器的共定位。
为什么有的基因做原生质体转化时荧光蛋白不亮?
不同物种的细胞可能对基因表达有影响,当在一种材料的原生质体中观察不到荧光时,可以考虑换一种受体材料。另外,如果是分泌蛋白,在原生质体中无法观察到荧光,此时可以考虑注射叶片来观察荧光。
拍摄时为什么有明场通道?
(1)显示细胞状态,有活力的原生质体细胞应该是饱满圆润的,变形或破碎的细胞说明此时细胞不是适状态或细胞已。
(2)显示荧光确实是细胞内蛋白表达的,而不是细胞碎片及杂质产生的杂光。
洋葱亚细胞定位的步骤一般包括以下内容:取材:选取适当的新鲜洋葱材料。
固定:使用适当的固定剂对洋葱材料进行固定,以便进行后续的实验操作。
切片:将固定好的洋葱材料切成薄片,以便观察。
荧光染料标记:选取适当的荧光染料,对洋葱细胞的亚细胞结构进行标记。例如,可以用荧光染料标记叶绿体或线粒体等细胞器。
观察:使用荧光显微镜观察标记的洋葱细胞的亚细胞结构,观察各细胞器的位置和分布情况。
分析:通过图像处理软件对观察到的亚细胞结构进行定性和定量分析,例如计算各细胞器的面积、周长、形状因子等参数。
总结:根据实验观察和分析结果,得出结论,总结出洋葱细胞的亚细胞结构分布和特点。
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