癌组织原位杂交实验步骤：

       1. 将准备做原位杂交的样本常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。

       2. 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。

       3. 石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合，室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。

       4. 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化3--30分钟（视标本新旧、厚薄自行调整）。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。

菌落的裂解及DNA结合于纤维素滤膜

（1） 在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/L NaOH的小洼（0.75ml），使菌落面朝上，将滤膜放到小洼上，展平保鲜膜，使滤膜均匀湿润，植物组织RNA原位杂交检测服务，让滤膜留于原处2-3分钟。

（2） 用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜，用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/L NaOH重复步骤（1）。

（3） 吸干滤膜，将滤膜转移到新的带有1mol/L Tris·Cl(pH7.4）的保鲜膜洼上。5分钟后吸干滤膜，再重复一次该步骤。

（4） 吸干滤膜，把它转移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4）的保鲜膜小洼上5分钟后吸干滤膜，转移到一张干的滤纸上，置于室温20-30分钟，使滤膜干燥。

（5） 将滤膜夹在两张干的滤纸之间，在真空烤箱中于80℃干烤2小时，固定DNA。

（6） 将固定在膜上的DNA与32 P标记的RNA进行杂交。

原位杂交第二天

1.

1）将探针回收，放于－20C保存（通常探针可重复使用十次左右）。

2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。

3）置换2XSSCT1ml，60℃，放置15分钟。

4）置换0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分钟，重复一次。

2.

1）用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。

2）室温下加1ml 1：2：7溶液，时间为一小时。

3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶连，4C 冰箱过夜。

植物组织RNA原位杂交检测服务-武汉科锐诺生物(图)由武汉科锐诺生物科技有限公司提供。武汉科锐诺生物科技有限公司为客户提供“外泌体,透射电镜,扫描电镜,石蜡切片等技术服务”等业务，公司拥有“科锐诺”等品牌，专注于技术合作等行业。，在湖北省武汉市江夏区神墩四路666号武汉国英种子A栋1楼的名声不错。欢迎来电垂询，联系人：王经理。