癌组织原位杂交实验步骤：

       1. 将准备做原位杂交的样本常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。

       2. 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。

       3. 石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合，室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。

       4. 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化3--30分钟（视标本新旧、厚薄自行调整）。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。

FISH是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质标记（间接或直接）而得名，该方法在80年代末 被发明，现已从实验室逐步进入临床诊断领域。基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火 温度下复性；通过荧光显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位）的前提下对靶核酸进行分析。DNA荧光标记探针是其中常用的一类核酸探针。利用此探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平 的分析。荧光标记探针不对环境构成污染，灵敏度能得到保障，可进行多色观察分析，因而可同时使用多个探针，缩 短因单个探针分开使用导致的周期过程和技术障碍。

荧光原位杂交技（fish）原理：是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。

       荧光原位杂交技（fish）实验步骤：

       1、组织固定：组织取出洗净后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。

       2、脱水：组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，包埋。

       3、切片：石蜡经切片机切片，摊片机捞片，分子病理技术服务，62°烤箱烤片2h。

       4、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲1苯Ⅰ 15min-二甲1苯Ⅱ 15min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min，风干，DEPC水浸泡。

       5、消化：根据组织固定时间长短，切片于修复液中煮沸10分钟，自然冷却。后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。

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