原位杂交第三天

1） 用1ml含10%热灭清的MABT溶液置换溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，分子病理技术服务，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，后用1mlMABT溶液置换，25分钟。

2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟。

3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。

4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色

5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。

6）4C冰箱保存。

滴加FITC-TSA：滴加FITC-TSA试剂，避光室温反应5min。后TBST洗3次×10min，PBS洗1次×5min。

DAPI复染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，冲洗后滴加抗荧光淬灭封片1剂封片。

镜检拍照：切片于尼康正置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FAM(488)绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm，发红光。）

原理

原位杂交技术是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。

经特定标记的核苷酸链为探针，可与组织切片、细胞或染色体标本中的待检DNA片段或mRNA进行杂交，然后显示标记物，从而分析待检核酸的分布和含量。利用此项技术可研究各种基因在染色体上的定位，编码某种蛋白质的mRNA在胞质中的表达。

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