阻断内源性过氧化物酶：滴加3%1甲1醇-H2O2，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

预杂交：滴加预杂交液，37°C孵育1h。

杂交：倾去预杂交液，滴加含探针has-circ-ST6GALNAC6 probe 杂交液，浓度6ng/ul，恒温箱37度杂交过夜。

杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。

滴加封闭液：滴加封闭血1清（正常兔血1清），室温30min。

滴加鼠抗地1高辛标记过氧化物酶（anti-DIG-HRP）：倾去封闭液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育50min，后PBS洗3次×5min。

        

原位杂交杂交液注意事项：

       （1）杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐类、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血1清白蛋白及载体DNA或RNA等。

       （2）杂交液中含有较高浓度的Na+可使杂交率增加，可以减低探针与组织标本之间的静电结合。甲酰胺可使Tm降低，杂交液中含每1%的甲酰胺可分别使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的杂交温度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。，所以杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。硫酸葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，茎原位杂交技术服务，以达到提高杂交率的目的（尤其对双链核酸探针）。

       在杂交液中加入牛血1清白蛋白及载体DNA或RNA等，都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。

点对点酵母双杂交验证实验流程

1、诱饵蛋白毒性及自激1活检测；

2、共转化：分别将诱饵/捕获质粒（pGBKT7-Bait/pGADT7-Prey）、阳性对照质粒（pGBKT7-p53/pGADT7-T）、阴性对照质粒（pGBKT7-Lam/pGADT7-T）分别共转到Y2H Gold感受态细胞中，涂布于DDO平板培养；

3、点板验证：分别从平板上挑单克1隆稀释10倍、100倍、1000倍，然后点板到TDO/X/A和QDO/X/A固体培养基进行验证；

4、实验数据与报告整理。

武汉科锐诺生物(多图)-茎原位杂交技术服务由武汉科锐诺生物科技有限公司提供。武汉科锐诺生物科技有限公司位于湖北省武汉市江夏区神墩四路666号武汉国英种子A栋1楼。在市场经济的浪潮中拼博和发展，目前科锐诺在技术合作中享有良好的声誉。科锐诺取得全网商盟认证，标志着我们的服务和管理水平达到了一个新的高度。科锐诺全体员工愿与各界有识之士共同发展，共创美好未来。