将32 P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟，迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。

杂交结束后，去除杂交液，立即于室温把滤膜放入大体积（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，染色体原位杂交，轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗 一次，植物原位杂交，同时应避免膜干涸。

68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次，原位杂交检测，每次1-1.5小时。此时已可进行自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60分钟。

原位杂交技术可以应用于以下场景：

组织中病毒DNA/RNA的检测和定位。例如，可以用于检测EB病毒mRNA、人类状瘤病毒和巨细胞病毒DNA等。

癌基因、抑癌基因及其他各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测。

检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色体易位等。

在植物基因组研究中的应用。例如，通过与特定基因序列的探针进行杂交，可以在植物染色体上定位到目标基因的位置，原位杂交，进而构建遗传图谱，为植物育种和基因组研究提供基础数据。

怎样保证原位杂交实验操作时的温度?

建议仪器操作，人工操作的话要注意：

（1）对荧光原位杂交操作过程中可能使用的一些仪器进行温控检查，不符合要求的进行更换。

（2）尽可能地保持环境温度在20度以上。

（3）针对需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。

（4）同时检测的样本不超过4块，操作一定要迅速，实验人员要注意一些小部件的温度，尤其是在冬季。

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