为什么有的基因定位结果与预想的不一致？

对于一个特定的定位载体，只要荧光表达较好，BIFC，其定位结果是确定的，不会随人为意愿或操作而改变。至于有时候和预想的结果不一样，可能和蛋白本身、选择的表达载体以及荧光蛋白融合方式等有关。

为什么有的普通定位结果出来后无法准确判断其定位位置？

细胞中的细胞器复杂且多样，除一些常见的、特征比较明显的细胞器外，有些细胞器在激光共聚焦下形状比较相似，例如：线粒体、过氧化物酶体、高尔基体等细胞器，它们的荧光表达形状可能都是点状，因此不易区分。这时可以结合基因的其他功能研究来判断其可能表达的位置。另外，蛋白表达本身也是一个复杂的过程，涉及到多个合成场所及转运过程，自身表达情况可能比较复杂，因此不易判断具体的表达位置。

为什么不先对一个基因做预测，在预测的结果上直接做共定位？

不同的预测网站有不同的计算方法，同一个基因在不同的预测网站也可能得出不同的定位结果。另外所有的结果都应是基于实验得到的，对于不清楚可能定位在哪里的基因，一般推荐先做普通定位，根据普通定位的结果再决定做哪种细胞器的共定位。

为什么有的基因做原生质体转化时荧光蛋白不亮？

不同物种的细胞可能对基因表达有影响，当在一种材料的原生质体中观察不到荧光时，可以考虑换一种受体材料。另外，如果是分泌蛋白，在原生质体中无法观察到荧光，此时可以考虑注射叶片来观察荧光。

拍摄时为什么有明场通道？

（1）显示细胞状态，有活力的原生质体细胞应该是饱满圆润的，变形或破碎的细胞说明此时细胞不是适状态或细胞已。

（2）显示荧光确实是细胞内蛋白表达的，而不是细胞碎片及杂质产生的杂光。

构建亚细胞定位载体时，GFP融合位置为什么有N端、C端之分？

若序列中存在信号肽，则构建载体时需避开这一端来融合荧光蛋白。需注意不同的融合方式可能会得到不同的定位结果，例如融合在荧光蛋白N端的目标蛋白一般无法得到过氧化物酶体的定位结果；融合在荧光蛋白C端的目标蛋白一般无法得到线粒体、质体的定位结果。

为什么不同的受体材料有时得到的定位结果不一样？

不同物种的细胞在翻译表达基因时，其表达模式和影响因子不同。受物种差异的影响，同一个载体在不同的受体材料中表达的位置可能不同，因此建议实验时尽可能选用与目的基因来源相近的受体材料进行表达。

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