原位杂交天

1. 重新水化和固定

1） 吸取固定好的胚胎，加入50%的PBST溶液，放置5分钟。

2） 置换成30%的PBST溶液，放置5分钟

3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次

4） 置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）

1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，tunel技术服务，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。

2） 用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。

3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。

4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

2. 预杂交

1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。

2）用等体积的HYB+取代HYB－。

3）60℃水浴，预杂交4小时以上。

3. 杂交

1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..

2）60℃ 温浴过夜。注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。

荧光定量PCR(realtimePCR)技术是近几年基于普通PCR技术发展的一种新技术。它借助荧光信号来检测PCR产物，通过荧光染料或荧光标记的特异探针，对PCR产物进行标记跟踪，在扩增过程中，每经过一次循环，荧光定量PCR仪就会收集一次荧光信号，实时检测整个PCR进程。用荧光定量PCR法检测目的基因仅需检测样本是否具有扩增信号即可，且PCR反应具有核酸扩增的高1效性，可检测出微小突变。根据探针标记不同可分为TaqMan探针法和AＲMS法。

既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态结构。

步骤：基本与免1疫组织化学技术相似，即组织要求新鲜和迅速投入固定液。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。取材过程中避免手指、唾液和未经RNA酶抑制处理的器具接触标本。冷冻切片以厚5~30um佳，40℃烤箱内干燥2小时后储存在-80℃超低温冰箱，在-20℃可保存２～３周，在-70℃可保存数月之久。