荧光原位杂交技（fish）原理：是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。

       荧光原位杂交技（fish）实验步骤：

       1、组织固定：组织取出洗净后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。

       2、脱水：组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，包埋。

       3、切片：石蜡经切片机切片，摊片机捞片，62°烤箱烤片2h。

       4、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲1苯Ⅰ 15min-二甲1苯Ⅱ 15min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min，风干，DEPC水浸泡。

       5、消化：根据组织固定时间长短，切片于修复液中煮沸10分钟，自然冷却。后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。

既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态结构。

步骤：基本与免1疫组织化学技术相似，即组织要求新鲜和迅速投入固定液。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。取材过程中避免手指、唾液和未经RNA酶抑制处理的器具接触标本。冷冻切片以厚5~30um佳，40℃烤箱内干燥2小时后储存在-80℃超低温冰箱，在-20℃可保存２～３周，植物RNA原位杂交检测服务，在-70℃可保存数月之久。

 滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗。

  .滴加生物素化鼠抗地1高辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。

DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。

.苏1木素复染，充分水洗。

酒精脱水，二甲1苯透明，封片。

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